Actualmente existe una demanda muy alta para producir aminas quirales, las cuales son compuestos de gran interés para la industria. Su síntesis puede realizarse mediante las enzimas w-transaminasas (wTA). Las principales ventajas del uso de wTA son su alta pureza enantioselectiva y que la reacción se puede realizar en un solo paso, aumentando la eficiencia y sostenibilidad del proceso. Sin embargo, para catalizar la síntesis de aminas quirales voluminosas, los wTA deben tener propiedades como la aceptabilidad de sustratos voluminosos y resistir las demandas de un proceso industrial, como los disolventes orgánicos y altas temperaturas. Por tanto, el principal objetivo de mi proyecto es generar y seleccionar variantes (mutantes) mejoradas de la transaminasa de Vibrio fluvialis (Vfat) en resistencia a disolventes y aceptación de un sustrato voluminoso mediante la integración simultánea de ingeniería de proteínas (PE) e inmovilización enzimática (EI) para la síntesis de aminotetralina, a partir de aminotetralona. Resolviendo así dos de los principales desafíos de la biocatálisis en la aminación de cetonas proquirales voluminosas. La integración de PE y EI se está realizando a través de una estrategia llamada Ingeniería de Biocatalizadores Inmovilizados (IBE), diseñada y validada en mi tesis doctoral (https://doi.org/10.1016/ j.ijbiomac.2020.12.097). En IBE ambas estrategias funcionan simultáneamente como una sola línea, basada en una integración conceptual y práctica para la obtención de mejores biocatalizadores. Mediante el uso de IBE, se pueden obtener biocatalizadores que no se seleccionarían mediante el screening tradicional (basado en el rendimiento de las enzimas solubles); y las bibliotecas de enzimas se seleccionan como biocatalizadores inmovilizados en un proceso de selección integrado obteniendo el biocatalizador tal como se usaría en el proceso de producción. Mi proyecto tiene tres objetivos específicos, cada uno de ellos desarrollado en una etapa. En la primera etapa, la enzima Vfat se inmovilizará sobre soportes de sílica funcionalizados con grupos glioxilo a partir de sobrenadante microbiano de células competentes de E. coli, expresadas de forma heteróloga. Además, se evaluará el comportamiento catalítico de la enzima soluble e inmovilizada frente a diversos solventes orgánicos para determinar las condiciones de inmovilización. En la segunda etapa, se utilizará IBE para obtener mutantes con resistencia a disolventes. Se utilizará la estrategia de evolución dirigida para generar diversidad genética en Vfat, ya que actualmente no existe un enfoque sencillo para predecir racionalmente la resistencia a los disolventes a partir de la estructura de la enzima 3D. Las variantes enzimáticas resultantes se inmovilizarán sobre un soporte de sílica funcionalizado; mediante el uso de la metodología de inmovilización enzimática high-throughput en microplacas, diseñada por nuestro grupo de investigación. Se realizará un screening integrado, que incorporará inmovilización y desafío de resistencia a disolventes. A través de IBE se espera obtener la(s) variante(s) inmovilizada(s) de Vfat resistente al disolvente. En la tercera etapa, la mejor variante obtenida por IBE se diseñará racionalmente para aceptar sustratos voluminosos y utilizarlos para sintetizar la amina quiral aminotetralina. Se espera que en esta última etapa se diseñe la biblioteca racional y se identifique la mejor variante de Vfat para la conversión de tetralona (sustrato voluminoso) en aminotetralina. Como novedad científica en este proyecto se obtendrá una enzima de interés industrial como biocatalizador activo, inmovilizado y robusto, que podría catalizar la síntesis de aminas quirales voluminosas y convertirse en un biocatalizador de rutina. Aunque la enzima que se debe mejorar es Vfat, sus desafíos no son exclusivos de las transaminasas, sino que son transversales para muchas enzimas. Actualmente se requiere un enfoque multidisciplinario para resolverlos y la plataforma IBE puede contribuir a su solución. La principal novedad tecnológica del proyecto será la extrapolación de IBE a otras enzimas, presentándola como una plataforma única de integración multidisciplinar para mejorar biocatalizadores de cara a su aplicación tecnológica. Se espera que este proyecto proporcione una herramienta para abordar los desafíos de la integración de disciplinas, lo que probablemente contribuya a consolidar la biocatálisis como una metodología práctica para diversos bioprocesos.

Vigencia: 2023-2026

Coordinadora: Karen Rodriguez Núñez